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Diagnosi

La clerance mucociliare e metodiche di studio

La diagnosi ultrastrutturale della Discinesia Ciliare Primaria (DCP)

La diagnosi molecolare della DCP e Sindrome di Kartagener


La clerance mucociliare e metodiche di studio

Gioia Piatti
Istituto di Malattie dell'App. Respiratorio
Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli
e Regina Elena, Fondazione IRCCS - Milano

La clearance mucociliare è il principale meccanismo di depurazione dell'albero respiratorio nei confronti dei microrganismi e delle sostanze nocive che penetrano in esso con l'aria respirata.

Questo meccanismo di difesa è fondamentale per mantenere l'albero respiratorio, al di sotto della trachea, sterile.

La sua efficienza dipende dall'interazione tra i due sistemi che ne fanno parte: le cilia ed il muco. Le cilia sono appendici delle cellule epiteliali respiratorie, capaci di movimento, grazie alla presenza di proteine contrattili nella loro struttura: sulla loro punta è adagiato un sottile film di muco che viene continuamente rinnovato poiché il movimento ciliare (battito ciliare) sposta il muco e le particelle in esso intrappolate, in direzione dell'orofaringe, dove le secrezioni vengono deglutite.

Le cellule ciliate (v. Fig. 1) sono presenti pressoché lungo il corso di tutto l'albero respiratorio, a partire dalla volta delle fosse nasali fino alle più piccole terminazioni bronchiali denominate "bronchioli terminali". Il movimento fisiologico delle cilia, paragonato spesso a quello di un campo di grano mosso dal vento, avviene con caratteristiche di metacronalità, ossia ogni cilio batte una frazione di tempo prima delle cilia successive e una frazione di tempo dopo di quelle che lo precedono.

figura 1

Fig. 1: Mucosa respiratoria ciliata vista al microscopio elettronico a scansione

Il movimento corretto delle cilia  , che avviene solitamente ad una frequenza di circa 12 Hz, è di importanza fondamentale perché il sistema di depurazione possa svolgere la sua funzione. D'altra parte, l'altro componente di questo sistema, il muco, deve avere delle caratteristiche tali da consentirne una buona trasportabilità: un muco troppo denso o troppo acquoso non consente una eliminazione ottimale delle particelle nocive

Si conoscono patologie genetiche che riguardano la secrezione del muco, come la "fibrosi cistica" (FC) e patologie genetiche caratterizzate da un malfunzionamento delle cilia, come la "discinesia ciliare primitiva" (PCD).

Il termine PCD indica in realtà un ampio spettro di patologie cliniche in cui si riconoscono alterazioni a carico degli epiteli ciliati dell'organismo. In questo termine sono comprese la "sindrome di Kartagener" e la "sindrome delle cilia immobili" , caratterizzate entrambe dalla presenza di un'alterazione congenita che determina una difettosa motilità ciliare a causa di diverse anomalie dell'assonema ciliare: la principale conseguenza clinica, essendo le cilia presenti nell'intero albero tracheobronchiale, è anzitutto una malattia respiratoria cronica. La gravità delle caratteristiche cliniche è variabile, ma solitamente la malattia si manifesta con infezioni ricorrenti delle vie aeree superiori e/o inferiori (sinusite, otite media, bronchite che esita spesso in processi suppurativi e bronchiettasie) e, in circa il 50 % dei casi, malposizionamento degli organi (destrocardia o situs viscerum inversus). Inoltre, poiché esiste un epitelio ciliato anche nell'apparato riproduttivo, si possono associare infertilità nel maschio (per le anomalie strutturali negli assonemi dello sperma che causano motilità ridotta o assente) e sub-fertilità nella femmina.

La malattia deve essere differenziata dalle altre patologie che possono portare ad alterazioni della clearance mucociliare di tipo secondario, come avviene nelle infezioni respiratorie, nella bronchite cronica, nelle bronchiettasie da varie cause, inclusa la fibrosi cistica, e nelle esacerbazioni dell'asma.

Figura 2

Fig. 2: Posizionamento endonasale della particella di saccarina

E' molto difficile studiare il movimento delle cilia in modo dinamico: un primo test piuttosto semplice e non invasivo, che può essere utilizzato anche nei bambini, a partire dai 5 anni di età, è il test della saccarina (v. Fig. 2): a livello nasale, una particella di saccarina del diametro di 1 mm viene posizionata sulla testa del turbinato inferiore: se il meccanismo della clearance mucociliare è funzionante, la particella viene trasportata fino all'orofaringe nel giro di circa 30 minuti e viene percepito un intenso sapore dolce. Un test normale, correttamente eseguito, esclude la diagnosi di PCD ed evita l'utilizzo di test più sofisticati e complessi. Se il tempo intercorso è maggiore di 60 minuti, allora si deve effettuare lo studio della motilità ciliare su brushing nasale o bronchiale.

Fig. 3: Esecuzione del campionamento delle cellule ciliate

Per lo studio della motilità ciliare ex-vivo si effettua uno spazzolamento o "brushing" della mucosa nasale (v. Fig. 3 e 4)

Fig.4: Spazzolino utilizzato per il campionamento

che consente di raccogliere piccoli frammenti di epitelio respiratorio ciliato: essi vengono posti in apposito medium di coltura per mantenere la vitalità cellulare, e dopo pochi minuti, vengono esaminati al microscopio ottico con contrasto di fase (v. Fig. 5). In tal modo è possibile valutare la presenza o meno delle cellule ciliate, definire le caratteristiche del movimento ciliare (monoplanare o multiplanare) e la morfologia del battito ed infine è possibile determinare la frequenza del battito ciliare. Nelle forme classiche di PCD il battito ciliare ha una frequenza notevolmente ridotta, solitamente < 5 Hz, si presenta asincrono, scoordinato e di tipo multiplanare; concomita spesso una discreta percentuale di cellule con cilia immobili, sebbene l'assenza totale di movimento sia piuttosto rara. La tecnologia più recente consente di registrare digitalmente le immagini ad alta frequenza in modo da poterle osservare nuovamente in modo rallentato e visualizzare le diverse tipologie di alterazione funzionale in modo ottimale (ev. filmato delle cilia in movimento).

Fig.5: Attrezzatura utilizzata per lo studio della funzionalità delle cilia

Nei casi in cui si riscontra un'alterata motilità ciliare, deve essere programmato un ulteriore brushing per lo studio delle cilia al microscopio elettronico a trasmissione: in tal modo, potendo osservare la superficie interna delle cilia, meglio quando le cilia sono presenti in sezione trasversale, è possibile determinare la presenza o meno di alterazioni ultrastrutturali, la più caratteristica delle quali, ma non unica, è l'assenza dei bracci interni o esterni di dineina. Si riconoscono anche altri tipi di alterazioni, meno frequenti, per la cui descrizione dettagliata si rimanda alla sezione specifica.

Una metodica complementare alle precedenti, ma di più recente introduzione è la misurazione dell'ossido nitrico nasale (NO): questo mediatore, importante per la regolazione del battito ciliare, è tipicamente ridotto nella PCD (valori circa 10 volte inferiori alla norma) e pertanto assume un valore diagnostico. L'apparecchio per la misurazione dell'ossido nitrico è un analizzatore di chemiluminescenza (v. Fig. 6). Questo esame è assolutamente non invasivo e può essere facilmente ripetuto anche nel tempo.

Fig. 6: Attrezzatura per la misurazione dell'ossido nitrico nasale

E' da tener presente che tutti questi esami, caratterizzati da una bassa o nulla invasività, devono essere effettuati in condizioni di benessere e di stabilità clinica, ovvero non devono essere in atto processi infettivi a carico dell'albero respiratorio o in corso trattamenti antimicrobici. Infatti, come già accennato, diverse patologie respiratorie acquisite possono provocare alterazioni secondarie della motilità ciliare che potrebbero essere motivo di erronea valutazione.

Bibliografia essenziale

1) Bush A, Cole P, Hariri M et al. Primary ciliary dyskinesia: diagnosis and standard of care. Eur Resp J 1998, 12: 982-988.

2) Noone PG, Leigh MW, Sannuti A et al. Primary ciliary dyskinesia. Diagnostic and phenotypic features. Am J Resp Crit Care Med 2004, 169: 459-467

3) Afzelius BA. Immobile cilia sindrome: past, present, and prospects for the future. Thorax 1998, 53: 894-897.

4) Afzelius BA. Cilia-related diseases. J Pathol 2004, 204: 470-477.

5) Lie H, Ferkol T. Primary ciliary dyskinesia. Recent advances in pathogenesis, diagnosis and treatment Drugs 2007, 67: 1883-1892.

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7) Carda C, Armengot M, Escribano A, Peydrò A. Ultrastructural patterns of primary ciliary dyskinesia sindrome. Ultrastructural Pathol 2005, 29: 3-8.

8) Wodehouse T, Kharitonov SA, Mackay IS et al. Nasal nitric oxide measurements for the screening of primary ciliary dyskinesia. Eur Resp J 2003, 21: 43-47.

9) de Santi MM, Gardi C, Barlocco EG, Canciani M, Mastella G, Lungarella G.Cilia-lacking respiratory cells in ciliary aplasia.Biol Cell. 1988; 64 (1): 67-70.

10) Bertrand B, Collect S, Eloy P, Rombaux P. Secondary Ciliary Dyskinesia in upper respiratory tract. Acta Otorhinolaryngol Belg 2000;54(3): 309-16.

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La diagnosi ultrastrutturale della Discinesia Ciliare Primaria

Maria Margherita de Santi

Dipartimento di Patologia Umana ed Oncologia
Sez. Anatomia Patologica
Università degli Studi di Siena

La Discinesia Ciliare Primitiva (PCD; OMIM#242650) comprende un gruppo di disordini ereditari, genotipicamente e fenotipicamente eterogenei dovuti ad alterazioni morfo-strutturali delle cilia mobili. I difetti degli assonemi ciliari dell'epitelio respiratorio determinano l'inefficienza della clearance muco-ciliare, che si manifesta clinicamente con infezioni croniche delle vie respiratorie. I maschi affetti sono subfertili per immobilità o ipocinesia degli spermatozoi, mentre nelle pazienti di sesso femminile si osservano frequentemente gravidanze ectopiche.Nel 50% circa dei pazienti si osserva Situs Viscerum Inversus (SVI), raramente Situs Ambiguus. L'associazione tra SVI, sinusite e bronchiettasie costituisce la classica triade nota come Sindrome di Kartagener. Nella prima metà degli anni 70 del secolo scorso, con l'avvento del Microscopio Elettronico a Trasmissione, la patogenesi della Sindrome di Kartagener è stata collegata ad alterazioni morfologiche degli assonemi da Afzelius et al.(1) e Pedersen et al., che descrissero l'associazione di sinusite, bronchiettasie, SVI con l'assenza delle braccia di dineina nei flagelli di spermatozoi immobili di pazienti infertili. Eliasson introdusse il termine "sindrome da cilia immobili" (ICS) per descrivere i difetti ciliari congeniti che determinavano alterazioni della clearance muco-ciliare ed infertilità maschile ma successivamente fu osservato in alcuni pazienti con ICS un debole ed inefficace movimento ciliare. Sleigh quindi propose di usare il termine " discinesia ciliare primaria" (PCD) per descrivere le alterazioni ultrastrutturali congenite delle cilia, mentre indicava come "discinesia ciliare secondaria" (SCD) i difetti ultrastrutturali acquisiti.

E' importante sottolineare che la sindrome di Kartagener è solo un sottogruppo della PCD: oggi sappiamo che SVI è causato da deficit della motilità di particolari cilia, dette nodali, responsabili della lateralizzazione degli organi, presenti in fasi precoci dello sviluppo embrionale (2). In alcuni soggetti, la PCD è associata con altri importanti disordini, tra i quali ricordiamo il rene policistico, la retinite pigmentosa, la Sindrome di Bardet- Biedl e la Sindrome di Usher, la cui patogenesi è stata collegata a difetti strutturali del ciglio primario (3).

I fenotipi nella PCD sono eterogenei ed alcuni aspetti clinici sono sovrapponibili a quelli riscontrabili in altre malattie congenite delle vie respiratorie, in primo luogo la fibrosi cistica ed il deficit di a-1 antitripsina. I disturbi respiratori possono insorgere alla nascita (distress respiratorio neonatale), durante l'infanzia e, raramente, in età adulta ed includono infezioni croniche delle vie aeree, superiori ed inferiori: le bronchiettasie non sono presenti alla nascita ma possono svilupparsi come complicanza delle broncopneumopatie croniche. La severità e la velocità di progressione della patologia sono variabili da un paziente all'altro e dipendono in primo luogo dal tipo di sub-strutture ciliari alterate ma anche dalla diagnosi precoce, che indirizza le scelte terapeutiche e lo stile di vita.

Nella maggior parte dei casi l'ereditarietà della PCD è autosomica recessiva, anche se sono state descritte famiglie con modalità di trasmissione autosomica dominante e X -linked (4). Poiché la PCD è una condizione geneticamente eterogenea, si suppone che mutazioni in geni differenti siano responsabili del diverso fenotipo, ma le basi della varietà dei difetti strutturali e funzionali delle cilia non sono ancora chiare: sono oltre 600 i polipeptidi costituenti l'assonema (5) e molti altri (IFT proteins) sono coinvolti nell'assemblaggio delle cilia (6): il numero dei geni candidati è dunque molto elevato. A tutt'oggi, come causa di PCD nell'uomo, sono state riconosciute le mutazioni di tre geni, DNAH1, DNAH5 e DNAH11, che codificano tutti per catene componenti le dineine del braccio esterno (7).

La prevalenza della PCD è sicuramente sottostimata e dovrebbe attestarsi su 1:15.000- 1:30.000 nati, come estrapolato da studi radiografici. La diagnosi richiede la dimostrazione diretta o indiretta dell'inefficienza del battito ciliare come risultato di deficit primitivi della struttura delle cilia e dovrebbe basarsi sul confronto tra la clinica, lo studio dinamico del trasporto muco-ciliare "in vivo" ed "in vitro" e lo studio ultrastrutturale dell'assonema (8).

L'analisi al Microscopio Elettronico a Trasmissione è ancora considerata il "golden standard" per la diagnosi di PCD, in quanto è l'unico modo per poter distinguere le anomalie ciliari primitive dalle secondarie. Per effettuare l'esame è sufficiente un campione minimo di epitelio respiratorio, prelevato con spazzolamento o scraping della mucosa nasale o bronchiale. E' necessario osservare almeno 50 sezioni perfettamente trasversali di cilia provenienti da cellule non adiacenti, avendo cura di valutare esclusivamente la porzione mediana del ciglio. L'incidenza di cilia anomale viene calcolata in percentuale, considerando che anche i soggetti normali possono avere fino al 10% di cilia alterate, in funzione dell'età e delle abitudini di vita. La perfetta conoscenza dell'aspetto ultrastrutturale delle cilia normali (Fig. 1) è indispensabile per la valutazione dei difetti ciliari.

 Fig. 1 Sezione trasversale di un ciglio normale (x110.000)

La struttura del ciglio mobile, invariato in tutte le cellule ciliate degli eucarioti, e' complessa e fornisce un classico esempio di adattamento morfo-funzionale: i meccanismi che ne regolano il movimento sono funzione dell'organizzazione molecolare delle singole componenti assonemali e della loro coordinazione. Ogni ciglio è circondato da una membrana specializzata, continua con la membrana citoplasmatica ed è ancorato al citoplasma apicale della cellula da un complesso apparato basale. La struttura ciliare interna, detta assonema, è costitutita da nove coppie di microtubuli periferici disposti in circolo attorno ad una coppia centrale, circondata da una guaina fibrosa. Ogni microtubulo è costituito da eterodimeri di a- e ß tubulina assemblati in protofilamenti. Le coppie di microtubuli periferici si connettono alla coppia centrale mediante i ponti radiali e sono collegate tra loro da ponti di nexina e dagli "arms" di dineina, esterno ed interno, che emergono con periodicità diversa dal microtubulo A. Le dineine sono eterodimeri ad alto peso molecolare costituiti da complessi di catene pesanti, intermedie e leggere; sono molecole dotate di attività ATP-asica, che svolgono funzioni differenti ma complementari nella generazione del battito ciliare. Il braccio esterno determina la forza e la frequenza del battito, l'interno ne influenza la curvatura. Il battito ciliare è dunque il risultato di un movimento di scivolamento reciproco tra le coppie di microtubuli periferici, consentito energeneticamente dall'idrolisi dell'ATP e mediato dalle strutture assonemali accessorie; è strettamente dipendente dall'integrità delle sub-strutture e dalla loro interazione. Nell'epitelio respiratorio ogni cellula ciliata contiene 200-300 cilia, ognuna delle quali batte circa 1000 volte al minuto, con una frequenza di 12-16 Hz. Il battito è asimmetrico e consiste di un colpo effettivo seguito da una fase di ritorno, per imprimere al muco un movimento propulsivo verso l'orofaringe. Per produrre un battito efficiente e coordinato (metacronale) è necessario inoltre che la coppia centrale abbia lo stesso orientamento nelle cilia adiacenti.

Lo spettro dei difetti ultrastrutturali osservati nella PCD è ampio, ma circa il 90% dei pazienti presenta alterazioni degli "arms" di dineina (Fig. 2).

Fig.2 PCD: a) assenza di entrambi gli "arms" di dineina; b) assenza del braccio esterno; c) assenza del braccio interno (x110.000)

Tra questi, la mancanza del solo braccio esterno rappresenta il tipo di anomalia più comune; seguono i deficit di entrambi gli "arms" ed infine l'assenza del solo braccio interno. Anomalie morfo-strutturali eterogenee, dovute ad alterazioni delle diverse strutture assonemali, sono responsabili del restante 10% dei casi di PCD. In particolare sono state descritte alterazioni a carico dei ponti radiali, che stabilizzano la struttura longitudinale del ciglio, l'assenza di uno o entrambi i microtubuli della coppia centrale, con eventuale trasposizione al centro di una coppia periferica, oppure anomalie primitive dell'apparato basale. Rarissima è l'aplasia ciliare, ovvero l'assenza totale di tutte le strutture assonemali (9).

Alcuni difetti ultrastrutturali delle cilia possono avere un'origine secondaria (Fig. 3). Cilia composte, alterazioni del numero e della disposizione dei microtubuli periferici, assonemi disorganizzati o difetti dell'allineamento possono essere la conseguenza di infezioni respiratorie, di farmaci oppure di traumi della mucosa: per definizione, sono reversibili e non interessano mai la totalità delle cilia. In tutti i pazienti affetti da patologie respiratorie croniche sono riscontrabili alterazioni ciliari di diversa natura ed entità e, d'altra parte, nei soggetti con PCD si osservano frequentemente anomalie ciliari acquisite eterogenee (10).

Fig.3 Alterazioni aspecifiche: d) cilia composte; e) eccesso di matrice citoplasmatica; f) alterazioni dell'orientamento (x71.000).

Le anomalie secondarie, se in alta percentuale, possono causare alterazioni della clearance (SCD), ed i test funzionali non sono in grado di distinguerle da quelle primitive: quindi, la diagnosi di PCD necessita dell'esame in Microscopia Elettronica a Trasmissione, che permette di rilevare e quantificare le alterazioni ultrastrutturali specifiche di tale malattia.

Bibliografia essenziale

1) Afzelius BA. A human syndrome caused by immotile cilia. Science 1976; 193:317-319.

2) Nokana S, Tanaka Y, OkadaY, Takeda s, Harada A et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell 1998; 95: 829-837.

3) Afzelius BA. Cilia- related diseases. J Pathol 2004; 204:470-477.

4) Narayan D, Krishnan SN, Upender M, Ravikumar TS, Mahoney MJ et al. Unusual inheritance of primary ciliary dyskinesia (Kartagener's sindrome). J Med Genet 1994; 31:493-96.

5) Dutcher SK. Flagellar assembly in two-hundred and fifty easy-to-follow steps. Trends Genet 1995;11:398-404.

6) Rosenbaum JL, Witman GB. Interflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3(11): 813-25.

7) Bush A, Chodhari R, Collins N, Copeland F, Hall P et al. Primary Ciliary Dyskinesia: current state of the art. Arch Dis Chil 2007; 92:1136-1140.

8) Noone PG, Leigh MW, Sannuti A, Minnix SL, Carson JL, Hazucha M, Zariwala MA, Knowles MR. Primary Ciliary Dyskinesia: diagnostic and phenotypic features. Am J Respir Crit Care Med 2004;169 (4): 459-67.

9) de Santi MM, Gardi C, Barlocco EG, Canciani M, Mastella G, Lungarella G.Cilia-lacking respiratory cells in ciliary aplasia.Biol Cell. 1988; 64 (1): 67-70.

10) Bertrand B, Collect S, Eloy P, Rombaux P. Secondary Ciliary Dyskinesia in upper respiratory tract. Acta Otorhinolaryngol Belg 2000;54(3): 309-16.

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La diagnosi molecolare della Discinesia Ciliare Primaria e Sindrome di Kartagener

Daniela Zuccarello
Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche
Centro di Crioconservazione dei Gameti Maschili (CCGM)
Direttore: 
prof. Carlo FORESTA 
Università degli Studi di Padova

La Discinesia Ciliare Primaria (PCD) e la Sindrome di Kartagener (KS) sono due quadri fenotipici entrambi riconducibili ad alterazioni delle proteine che costituiscono l'assonema. A parte poche famiglie in cui è stata descritta sia una trasmissione di tipo autosomico dominate che di tipo X-linked [Narayan et al., 1994; Alvarez González et al., 2006], la PCD/KS è di solito trasmessa per via autosomica recessiva, ovvero sono necessarie due copie mutate dello stesso gene (paziente omozigote) o di geni diversi (paziente eterozigote composto) ereditate da entrambi i genitori, che sono portatori sani (soggetti eterozigoti).

I geni maggiormente coinvolti nella PCD/KS sono quelli che codificano per le Dineine, proteine che costituiscono il braccio assonemale esterno, particolarmente presenti nella trachea e nel testicolo [Storm van's Gravesande et al., 2005; Zariwala et al., 2007]. Mutazioni in uno di questi 3 geni sono state riscontrate nel 20-30% dei pazienti PCD/KS. Questa bassa percentuale di diagnosi molecolari trova ragione nel fatto che le proteine che costituiscono l'assonema sono circa 600, e che tutte sono potenzialmente candidate a causare alterazioni di questa struttura. Le tre dineine attualmente implicate nello sviluppo del fenotipo PCD/KS sono DNAI1 (catena intermedia 1 della dineina assonemale), DNAH5 (catena pesante 5) e DNAH11 (catena pesante 11). I geni delle dineine hanno una struttura complessa e sono costituiti da un elevato numero di esoni (porzioni codificanti del gene), e questo rende il loro studio lungo e difficoltoso.

Il Centro di Crioconservazione dei Gameti Maschili (CCGM) di Padova da anni si occupa delle problematiche genetiche relative all'apparato assonemale, non solo eseguendo le relative indagini molecolari, ma anche seguendo negli anni il paziente PCD/KS adulto per le problematiche relative all'infertilità causata da astenozoospermia (spermatozoi lenti o immobili).

Presso il CCGM si eseguono, in convenzione con l'Azienda Ospedaliera di Padova, le seguenti indagini per patologie legate alla struttura assonemale:
- Microscopia elettronica di spermatozoi e/o brushing bronchiale/nasale
- Analisi di mutazione per i geni:

  • DNAI1
  • DNAH5 
  • DNAH11
  • TXNDC3
  • TEKTIN-2

Nei primi 4 geni sono state riscontrate mutazioni in pazienti PCD/KS, mentre dell'ultimo esistono dati solo per il modello animale e pazienti con astenozoospermia isolata. Procedendo sistematicamente dal primo all'ultimo gene è possibile riscontrare mutazione/i in circa il 30% dei pazienti KS, nel 20% dei pazienti con PCD isolata, e nel 10% dei pazienti con AZS isolata.

Tali indagini vengono eseguite, su richiesta del paziente o del curante, in caso di discinesia ciliare, sindrome di Kartagener, astenozoospermia grave sine causa. Presso il Centro è anche possibile effettuare la valutazione del liquido seminale tramite test funzionali finalizzati all'inquadramento dell'astenozoospermia.

A conclusione delle indagini (60 giorni), il paziente e il curante ricevono un referto scritto con i risultati ottenuti e le indicazioni per ulteriori approfondimenti. In caso di riscontro di mutazione, viene effettuata una consulenza genetica con un medico specialista.

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